Hur stänger man av en gen?

Bakgrund

Den centrala dogmen i molekylärbiologi består i att DNA (deoxyribonucleic acid) bär på den genetiska informationen som sedan översätts till RNA (ribonucleic acid) och slutligen protein. På detta sätt utgör DNA och RNA grunden till protein.

DNA, RNA och protein (enzymerna som katalyserar de kemiska reaktionerna står även utmärkta i bilden).

DNA-sekvensen innehåller med andra ord basinformationen som förs över till en RNA-molekyl. RNA-sekvensen kan sedan bli översatt till ett protein, som bygger upp cellen och dess funktioner. År 2006 belönades forskarna Andrew Fire och Craig Mello med Nobelpriset i fysiologi eller medicin för upptäckten av siRNA.

Vad är siRNA?

Metoden som används kallas för siRNA-transfektion, vilket innebär att främmande genetiskt material förs (transfekteras) in i celler. Det främmande genetiska materialet är siRNA, som är en kort dubbel-strängad RNA-molekyl, ungefär 21 baspar lång, som inte ger upphov till något protein.

Om en forskare har intresse i en specifik gen, så kan färdigdesignade siRNA köpas från ett företag eller designas själv. De siRNA som beställs från företag är ofta testade för funktion, vilket innebär att de slår ner uttrycket av RNA:t och proteinet av intresse. Det är dock alltid viktigt att studera att siRNA:t verkligen stänger ner både RNA- och proteinuttrycket efter en viss behandlingstid. Vid beställning av färdiga siRNA-sekvenser och även vid egen design, så är det viktigt att beställa flera olika siRNA som binder in till olika ställen på målgenen för att kunna jämföra hur effektivt RNA:t och proteinet nedregleras i cellen.

Molekylär struktur av DNA, RNA och protein.

Det är alltid viktigt att använda ett kontroll-siRNA. Kontrollen är också 21 baspar lång, som ett vanligt målsökande-siRNA, men har en sekvens som inte överlappar någon gen och kan därför inte slå av uttrycket på RNA eller protein. Kontrollerna kan köpas från företag eller så kan en forskare designa dem på egen hand.

Hur kommer siRNA in i cellen?

Det mest vanliga sättet att föra in siRNA i celler är att använda en så kallad transfektionsreagens. Dessa är ofta fetter som är positivt laddade och omhuldar siRNA-molekylen och binder starkt till det negativt laddade plasmamembranet som omger en cell samt till den negativt laddade DNA-molekylen väl inne i cellen.

Genom att binda till en specifik gen som innehåller samma sekvens, så startar siRNA:t en nedbrytningsprocess. Väl i cellen så har siRNA:t inkorporerats i ett komplex som innehåller enzym som klyver RNA. När siRNA väl har hittat sitt mål-RNA så bryts RNA-molekylen ner innan det blivit till ett protein. Detta leder till att både RNA- och proteinuttrycket avbryts (interfering) och din ”målgen” är avstängd.

Dubbelsträngat (ds)RNA förs in i cellen, molekylen klyvs och siRNA inkorporeras i ett RNA-klyvningskomplex. RNA från cellkärnan (rosa) går ut i cytoplasman (gult)  och blir där nedbrutet.

Dock är effekten bara transient, övergående, så om långvariga experiment ska utföras behöver processen upprepas. Då får cellerna som redan siRNA-behandlas ytterligare en siRNA-behandling, för att kunna göra ett något längre experiment. Ifall långvarig avstängning av gener krävs, så kan det åstadkommas via andra tekniker.

Hur vet man om experimentet har fungerat?

Kontroll och målsökande siRNA förs in i celler som sedan skördas vid olika tidpunkter för att analysera uttrycket av det RNA och protein som skulle stängas av. Det är då viktigt att inkludera en kontroll, vilket kallas för ”housekeeping gene” på engelska eller laddningskontroll på svenska. Detta är ett RNA eller protein som är konstitutivt uttryckt och upprätthåller en basal funktion i cellen som även håller en jämn uttrycksnivå under normal- eller sjukdomstillstånd. Generellt sett brukar olika delar av cytoskelettet användas, vilket är ett dynamiskt nätverk av proteiner som håller upp cellen från cellkärnan ut till cellmembranet. Då kan en forskare observera huruvida målgenen har nedreglerats jämfört med kontroll-siRNA samt kontrollgenen och vid vilken tidpunkt nedregleringen är högst, exempelvis 24, 48 eller 72 timmar efter siRNA tillsatts till cellerna.   

Det finns även siRNA som är kopplade till olika fluorescenta, eller självlysande, molekyler som efter siRNA-transfektion kan studeras i mikroskop. Då kan man få en uppfattning om hur många celler tagit upp siRNA-molekylen.

Det är även möjligt att processer störs som just intresseproteinet är inblandat i. Protein som arbetar i komplex eller signalerar till varandra på olika sätt kan störas när en gen nedtystas av siRNA, men detta ger generellt sett mer förståelse för genens funktion. Efter siRNA-behandling kan cellerna observeras via mikroskop, för att se om några förändringar skett jämfört med kontroll-siRNA. Stimulus kan även adderas för att utforska en specifik funktion. Flera gener kan slås ut samtidigt.        

Det går även att jämföra en inhibitor mot ett protein med ett siRNA och de molekylära signaleringsmekanismerna kan bedömas i olika experiment. Det är dock viktigt att förstå att ett siRNA tar bort genens uttryck medan en inhibitor binder upp ett protein och hämmar dess funktion. Därför är proteinet ofta stabilt vid användning av en inhibitor, medan det slås ned av siRNA.

I kliniken

I augusti 2018 godkändes den första kliniska siRNA-behandlingen av läkemedelsverket i USA mot en ovanlig men allvarlig sjukdom kallad familjär amyloidos med polyneuropati, även kallad Skelleftesjukan. Skelleftesjukan är en genetisk sjukdom, alltså ärftlig, som leder till att proteiner ackumuleras i nerver, hjärta, mage, ögon, tarmar och njurar. Sjukdomen är dödlig och har tidigare behandlats med levertransplantation, då levern främst producerar de skadliga proteinerna som ackumulerar i kroppen. Omkring 450 patienter är drabbade av Skelleftesjukan i Sverige och har fått sitt namn då sjukdomen är vanligare i norra Sverige runt Skellefteå och Piteå. siRNA-läkemedlet som utvecklats kallas för Onpattro och slår ner genen som leder till en anormal produktion av proteiner som ackumuleras i nerver och organ, vilket förbättrar symptomen patienten lider av. Dessa inkluderar lägre muskelstyrka, sämre känsel, blodtrycksfall, oregelbunden hjärtrytm, förstoppning och diarré, gångsvårigheter och problematik kring vanliga dagliga aktiviteter. Utvecklingen av ett funktionellt läkemedel baserat på siRNA kan förhoppningsvis leda till fler effektiva behandlingar av olika sjukdomar.   

Sammanfattning

I princip alla gener kan slås ut med hjälp av siRNA-tekniken, så det är ett otroligt viktigt redskap vid valideringen av genfunktion samt för att besvara frågor kring läkemedelsutveckling även om dessa processer kan skilja sig mycket åt.